DESENVOLVIMENTO DE PROTOCOLO PARA CRIOPRESERVAÇÃO DE FOLÍCULOS OVARIANOS DE PEIXES USANDO VITRIFICAÇÃO

A criopreservação de embriões de peixes vem sendo investigada há mais de duas décadas, entretanto todos os protocolos testados até o momento falharam. A utilização de oócitos, mais recentemente, foi relatada como uma alternativa, no entanto, a maioria dos estudos foram realizados utilizando uma única técnica - o congelamento lento controlado – que ainda não se mostrou eficiente. A vitrificação, por outro lado, é um método de criopreservação ultrarápido que ocorre sem a formação de cristais de gelo, apresentando um melhor potencial para superar algumas das dificuldades relacionadas com a criopreservação de oócitos de peixes. No presente estudo desenvolveu-se um protocolo de vitrificação para folículos ovarianos de zebrafish em estádio III, onde a minha participação foi focada na coleta e seleção dos folículos ovarianos. Para tal os animais foram anestesiados utilizado óleo de cravo (Eugenol), numa diluição de 1:10 (Eugenol- Etanol). Após a localização dos folículos foi feita a retirada dos mesmos e em seguida foram conservados no meio L-15 (Leibovitz). Os oócitos foram avaliados e selecionados pelo seu tamanho e coloração. No projeto também faz parte a investigação do efeito do protocolo de vitrificação sobre os folículos em nível subcelular, através da medição da concentração de ATP citoplasmático e da distribuição e atividade mitocondrial, utilizando sonda fluorescente JC-1 e microscopia confocal. Ao final observou-se que a integridade mitocondrial das células da camada da granulosa foi claramente prejudicada pelo protocolo de vitrificação e o nível de ATP nos folículos diminuiu significativamente (P < 0,05) após o aquecimento. A vitrificação de folículos ovarianos de zebrafish em estádio III e seu efeito em nível de subcelular são relatados aqui pela primeira vez. As informações obtidas a partir deste estudo serão muito úteis para guiar o desenvolvimento e otimização de um protocolo para a criopreservação de oócitos de peixes no futuro.